實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）指的是在PCR進行的同時，對其過程進行監測的能力（即實時）。因此，數據可在PCR擴增過程中，而非PCR結束之后，進行收集。這為基于PCR的DNA和RNA定量方法帶來了革命性的變革。在實時熒光定量PCR (qPCR)中，反應以循環中檢測到目標擴增的時間點為特征，而非在一定循環數后目標分子累計的擴增量。目標核酸的起始拷貝數越高，則會越快觀察到熒光的顯著增加。相反，終點法檢測（也稱 “讀板檢測”）測量的是PCR循環結束時累計的PCR產物量。
概述
我們開發了兩種通過使用序列檢測系統（SDS）儀器進行PCR產物檢測的試劑：
TaqMan方法
TaqMan方法通過采用熒光探針在PCR循環過程中隨著特定PCR產物的累計而對其進行檢測。
使用TaqMan方法的檢測類型
TaqMan方法可用于以下檢測類型：
定量，包括：
SYBR Green I染料試劑
SYBR Green I染料法采用了Applied Biosystems™ SYBR™ Green I染料，一種可以在PCR循環過程中隨著PCR產物的累計而對其進行檢測的高度特異性雙鏈DNA結合染料。TaqMan和SYBR Green I染料法為重要的區別在于SYBR Green I染料試劑可以檢測所有雙鏈DNA，包括非特異性的反應產物。因此這樣經過特別優化的反應體系，對于獲取準確的結果而言是非常必要的。
使用SYBR Green I染料法的檢測類型
SYBR Green I染料法可用于以下檢測類型：
TaqMan試劑
背景
初，使用嵌入式染料進行實時熒光PCR (qPCR) 產物定量。但這些染料存在重大缺點，即會同時檢測特異性以及非特異性PCR產物的擴增量。
TaqMan方法的開發
通過引入基于Taq DNA聚合酶5’核酸酶活性的熒光標記探針，實時定量PCR系統得到了顯著提升。這些熒光探針的使用，使得實時定量的方法得到了發展，實現了僅對特定擴增產物的檢測。此外，熒光標記探針的開發，也免去了用于探針降解分析的PCR反應后處理過程。
TaqMan序列檢測方法的工作原理
TaqMan試劑通過采用熒光探針在PCR循環過程中隨著特定PCR產物的累計而對其進行檢測。工作原理：
步驟、過程
兩種類型的 TaqMan 探針
我們可提供兩種類型的Applied Biosystems™ TaqMan® 探針：
推薦用于等位基因檢測的 TaqMan MGB 探針
我們一般推薦使用TaqMan MGB探針進行等位基因分型分析，特別是當傳統TaqMan探針超過30個核苷酸時。TaqMan MGB探針包含：
終，TaqMan MGB 探針會在匹配和未匹配探針之間展現出更大的 Tm 值差異，從而提供更準確的等位基因分型。
TaqMan 方法的優點
TaqMan方法的優點如下：
TaqMan方法的缺點：
TaqMan方法的主要缺點在于需要根據不同的序列，合成不同的探針。
背景
一般將可與雙鏈DNA發生結合的小分子分為以下兩類：
無論哪種結合方法，用于PCR實時檢測的DNA結合染料都需要滿足以下兩個條件：
我們開發更加優化的條件，使得SYBR Green I染料的使用不會對PCR產生抑制并帶來相對于溴化乙錠更為靈敏的檢測。
SYBR Green I染料法的工作原理
SYBR Green I染料法通過SYBR Green I染料與PCR過程中產生的雙鏈DNA結合，而對聚合酶鏈反應（PCR）的產物進行檢測。工作原理：
步驟、過程
當SYBR Green I染料被加入到樣品中后，它可立即與樣品中的雙鏈DNA進行結合 。
SYBR Green I染料法的優點
SYBR Green I染料法的優點如下：
SYBR Green I染料法的缺點：
SYBR Green I染料法的大缺點在于可能會產生假陽性信號；即，因為SYBR Green I染料可與任何的雙鏈DNA發生結合，因此也會與非特異性的雙鏈DNA序列發生結合。
其他注意事項
采用DNA結合染料的另一原因，是多重染料與單一擴增分子的結合。這可提高擴增產物檢測的靈敏度。基于多重染料的結合，將迎來信號量取決于在反應中所產生的雙鏈DNA量的局面。因此，如果擴增效率相同，相較于對較短產物的擴增，對較長產物的擴增將會產生更多的信號。這*不同于熒光探針，使用熒光探針時，對于每個合成的擴增分子淬滅僅釋放一個熒光基團，與其長短并不相關。
什么是定量檢測？
定量檢測是一種實時的PCR (qPCR) 檢測。測量（定量）每輪PCR擴增循環中，檢測目標核酸片段的量。目標分子可以為DNA、cDNA或RNA。此方法指南主要對以下三種定量檢測進行討論：
定量分析常見術語
擴增子：PCR過程而產生的DNA短片段
擴增曲線：根據熒光信號相對于循環數而制作的曲線
基線：PCR起始時，熒光信號還未發生變化的幾個循環
Ct（閾值循環）：熒光信號超過NTC（無模板對照樣品）固定閾值時的循環數 。用于對擴增質量進行驗證。
核酸目標：（也稱為“目標模板”）——需要擴增的DNA或RNA序列
惰性參比染料： 一種可作為內部對照，以用于在數據分析時對報告基團染料信號進行均一化的染料。均一化是對因濃度或體積變化而隨之引起波動進行的必要校正。所有的SDS PCR試劑盒都提供了參比熒光對照。
Rn（均一化報告基團）：報告基團染料釋放的熒光強度除以惰性參比染料釋放的熒光強度
Rn+: 一次反應的Rn值包含所有的組分，包括模板
Rn-：未反應樣品的Rn值。Rn值可通過以下方式獲取：
ΔRn (delta Rn): 在特定PCR條件設置下所產生的信號量級。
ΔRn可通過以下公式計算：(Rn+) – (Rn-)標準品 具有已知濃度的A樣本，用于繪制標準曲線。通過使用不同濃度的標準品，您可構建用于未知樣品定量分析的標準曲線。
閾值：早期PCR循環時Rn值的平均標準差，乘以相應的校正系數閾值應當設定在PCR指數擴增時的相關區域。
未知：具有未知模板量的樣品。即，您需要進行檢測的樣品。
實時PCR (qPCR) 定量檢測工作原理
在PCR的起始循環中，熒光信號幾乎不發生變化。從而定義為擴增曲線中的基線。而超出基線部分的熒光的增加，則為對累計目標分子的檢測。固定的熒光閾值線，可設置在基線之上。熒光超過固定閾值時的循環數則為參數CT（閾值循環）。
概述
當對定量檢測的結果進行計算時，可以采用或相對定量。
什么是定量？
定量檢測是根據標準曲線對未知樣品進行的定量。
示例
定量可根據病毒的拷貝數，監控疾病狀態。研究者須知道特定生物學樣品中目標RNA分子的準確拷貝數，以對疾病的進展進行監測。定量可通過從所有SDS儀器獲取的數據進行，但注意標準品的定量則須首先通過其他方法獲取。
什么是相對定量？
相對定量用于分析特定樣品相對于參照樣品（比如，未處理的對照組）某個基因表達量的變化。
示例
相對定量可用于檢測化合物（藥物）引起的基因表達改變。經化學處理樣品中的特定目標基因的表達水平可與相對未處理樣品中的基因表達水平進行比較。
相對定量的計算方法
相對定量可根據從所有SDS儀器獲取的數據而進行。用于相對定量的計算方法有：
確定使用哪種方法 所有方法都可產生同等的結果。當在確定使用哪種方法時，需要注意：
常用術語
和相對定量中常用的術語，如下：
標準：用于構建標準曲線的已知濃度樣品。
參考文獻：用于對實驗結果進行均一化的陰性或陽性信號。內源性和外源性對照是常見的陽性對照。陽性對照指的是因 PCR擴增 而產生的信號。陽性對照則具有自己的引物和探針組合。
內源性對照：指的是，在每個樣品進行提取時便已存在于樣品中的RNA或DNA。當采用內源性對照作為陽性對照時，您可通過對信使RNA（mRNA）的均一化定量來消除每次反應中加入的總RNA量的差異。
外源性對照：指的是，在每個樣品中加入的具有已知濃度的特殊RNA或DNA。外源性陽性對照通常是來自可以作為內部陽性對照（IPC）的體外成分，可區分真正的目標陰性和PCR抑制。此外，外源性對照還可均一化樣品提取或逆轉錄中互補DNA（cDNA）合成的效率差異。無論是否使用陽性對照，使用含有ROX染料的參比熒光對照都是十分重要的，因為它可以對非PCR相關的熒光信號波動進行均一化。
目標分子的均一化量：一個可以用于比較不同樣品中目標分子相對量的無單位數字。
校準品：可以用作比較結果基礎的樣品。
概述
因采用的是相對于基礎樣品的表達量，例如校準品，用于相對定量的標準曲線一般都比較容易繪制。對于所有的實驗樣品，其目標分子的量均是從標準曲線獲取，然后除以校準品的目標分子量而確定的。因此，校準品便成為1 X 樣品，而所有其他的量則都為以n倍校準品來表示。例如，在研究藥物對表達產生的影響時，未處理的對照樣品便是合理恰當的校準品。
關鍵指南
以下指南可為相對定量中標準曲線的正確使用，提供關鍵指導：
內源性對照
對于內源性對照進行擴增可用于對加入至反應的樣品RNA或DNA的量進行標準化。對于基因表達定量，研究者采用過 ß-肌動蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、核糖體RNA（rRNA）或其他RNA作為內源性對照。
標準品
由于樣品量會除以校準品的量，則標準曲線中的單位便被去除了。因此，對于標準品來說所有需要知道的只是它們的相對稀釋比。對于相對定量，任何含有合適目標分子的RNA或DNA儲存液都可用作標準品。
比較CT法與標準曲線法相似，只是它利用的是算術公式2−ΔΔCT來獲取相同的相對定量結果。
算術公式：
為了有效地利用比較 CT 法，目標分子（基因）和對照（內源性對照）的擴增效率應當近似相同。
更多關于使用比較CT法進行相對定量的信息，請參閱用戶手冊#2：基因表達的相對定量（PN4303859）。
概述
用于定量的標準曲線法與用于相對定量的標準曲線法類似，只是標準品的量必須首先通過其他獨立方法獲取。
關鍵指南
下面的指南對于定量中標準曲線的正確使用十分關鍵：
無法使用DNA作為RNA定量的標準品，因為對于逆轉錄過程的效率沒有對照。
標準品
標準品的量必須首先通過其他獨立的方法獲取。質粒 DNA 和體外轉錄的 RNA 通常用于制備標準品。濃度可在A260 處被測量得到，并通過使用DNA或RNA的分子量轉化成拷貝數。
